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Nato nella provincia veneta, a Mira, il 21 settembre 1897, da famiglia veneziana, studiò matematica e filosofia, laureandosi a Padova. Qui fu allievo e assistente del triestino Vittorio Benussi, del quale nel 1927 fu successore alla cattedra di psicologia. È di questi anni, accanto a Benussi, il sorgere del suo interesse personale e culturale per la psicoanalisi. Reintegrato nell'insegnamento universitario dopo essere stato allontanato in seguito alle persecuzioni razziali, al termine della guerra divenne direttore dell'Istituto di Psicologia nell'Università di Milano.
Ancora a Milano, intorno a Musatti si venne formando, nel quadro della S.P.I., il gruppo psicoanalitico del Nord Italia, organizzatesi successivamente nell'Istituto e nel Centro Milanese di Psicoanalisi. Fu ripetutamente Presidente della S.P.I. e per lunghissimo tempo presidente del Centro Milanese.
Insieme a Nicola Perrotti ed Emilie Servadio avviò la pubblicazione della Rivista di Psicoanalisi, organo ufficiale della S.P.I., a cui diede impulso particolare e configurazione derivanti dalla sua esperienza nel campo della ricerca e dell'editoria scientifica. La sua opera di scienziato, vastissima, coniuga interessi per la psicologia sperimentale (Musatti tra l'altro ha promosso e diffuso in Italia la teoria della forma), con quello per la psicoanalisi e la ricerca psicoanalitica (i vertici ne sono le edizioni del Trattato di Psicoanalisi e la cura della traduzione italiana dell'opera di Freud). Esempi significativi di tutto questo si riscontrano in alcuni scritti, noti e meno noti: “Elementi di psicologia della testimonianza” ; “La dottrina psicoanalitica degli istinti” ; “La funzione del sogno” ; “Intorno al meccanismo dell'allucinazione” del 1947 (nel quale Musatti, precorrendo temi attualissimi della ricerca in psicoanalisi, prende in considerazione in modo del tutto originale i rapporti fra allucinazione negativa e allucinazione positiva, percezione, rappresentazione e assenza);